Dünnschichtchromatographie

von Jonny Appleseed; Übersetzung Christine Bandow

Bei der Arbeit mit einigen Pflanzen und Substanzen ergibt sich oft das Problem, des Nachweises einzelner chemischer Verbindungen. An dieser Stelle wird die Dünnschichtchromatographie interessant. Aufgrund ihres einfachen Aufbaus und der geringen Anforderungen, ist sie auch für die Arbeit in der weniger professionellen Umgebung einer privaten Forschungsstätte geeignet. Anmerkung: Man sollte die Kammer vor dem Einlegen der Platten einige Zeit verschlossen stehen lassen, damit sich die Luft darin mit Lösungsmitteldämpfen sättigt. Sonst kann die Lösungsmittelfront austrocknen, bevor eine sinnvolle Steighöhe erreicht wird.

Die Dünnschichtchromatographie ist eine Methode zur Identifikation von bestimmten chemischen Verbindungen. Vergleicht man farbige Proben einer unbekannten Substanz mit ähnlichen Proben einer bereits bekannten Substanz – jeweils mit Hilfe von Lösungen auf einer Kieselgel -Platte aufgebracht- hat man eine gute Chance die unbekannte Substanz zu identifizieren.

Benötigtes Material:

1. Chromatographie -Kammer: Rubbermaid Behälter, Größe 1,6 Liter (ca. 8x22x15cm) oder ähnliches

2. Chromatographie-Lösung: Methylenchlorid (Dichloromethan) CHCl, Methanol, konzentriertem Ammoniak in Verhältnissen von 80:15:1

3. Chromatographie-Platten: Alltech Polyram Kieselgel Plastikplatten 20x20cm oder etwas entsprechendes

4. Ehrlich’s Reagens: z.B. von Alltech

5. Xanthydrol: z.B. von Sigma

6. Preval Farben-Sprayer: aus dem Autozubehörhandel [Es kann auch jeder andere gleichmäßige Zerstäuber eingesetzt werden. Die Pravel- Teile sind eine Art nachfüllbare Spraydose, die Druckflasche wird auf einem Behälter befestigt und beinhaltet den Sprühkopf. Wichtig ist, dass ein gleichmäßiger Nebel erzeugt wird.]

7. Mikropipette: 25-30 Mikroliter

8. Flasche mit standardisiertem oder bekanntem Pflanzenextrakt als Referenz

9. UV – Licht

Durchführung:

Schneiden Sie die Kieselgelplatten in 10x10cm große Quadrate. Ziehen Sie mit einem weichen Bleistift eine Linie parallel zum unteren Rand, ca. 1,25cm davon entfernt. Dies ist der Anfangsbereich, in dem die Proben aufgetragen werden. Ziehen Sie senkrecht dazu Striche, so dass maximal sieben Spuren entstehen, wobei an den Seiten jeweils ca. 3mm Rand gelassen werden sollten. Nummerieren Sie die Platte am oberen Ende und halten Sie alles in Ihren Aufzeichnungen fest.

Benutzen Sie für jede Probe eine neue Mikropipette! Geben Sie von jeder Probe einen Tropfen mittig auf je eine Spur, direkt auf die waagerechte Bleistiftlinie. Dieser Extrakt sollte mittels Methylenchlorid (CH1Cl2) oder Alkohol hergestellt sein. Die standardisierte Probe kommt auf die mittlere Spur. Die standardisierten Proben können aus Pflanzen gewonnen werden, welche die gewünschten Alkaloide enthalten; diese Pflanzen sind größtenteils über den Versandhandel erhältlich.

Tauchen Sie eine Mikropipette in die zu untersuchende Lösung, sie wird durch die Kapillarkräfte einen Teil davon aufnehmen. Tupfen Sie nun einen möglichst kleinen Tropfen der Lösung auf die Platte und pusten Sie vorsichtig, um diese zu trocknen, dann wiederholen Sie diesen Vorgang bis die Pipette alle ist. Verteilen Sie auf diese Weise nacheinander 1-3 Pipetten der Lösung (abhängig von der Konzentration) auf der Startlinie über die Breite der Platte. Bewahren Sie das Extrakt der bekannten Pflanze in einem fest verschlossenen Behälter auf, so dass es nicht verunreinigt wird, und stellen Sie diesen am besten in den Kühlschrank.

Wenn Sie die Platte soweit vorbereitet haben, geben Sie so viel Chromatographie-Lösung in die Chromatographie-Kammer, bis die Lösung ca. 6mm hoch steht. Dann platzieren Sie die Platte so (hochkant) in der Kammer, dass sich die Proben oberhalb des Lösungsspiegels befinden. Legen Sie den Deckel verkehrt herum auf die Kammer, so dass er durch den sich entwickelnden Druck der verdampfenden Lösungsmittel nicht weggesprengt werden kann und lassen Sie das Ganze „ruhen“.

Die Lösung fängt nun an, sich auf der Platte hochzubewegen, wobei sie die verschiedenen Moleküle in unterschiedlichen Geschwindigkeiten befördert. Nach ca. 15-20min, wenn die Lösung ca. 3/4 der Plattenhöhe erreicht hat, nehmen Sie die Platte aus der Kammer. Markieren Sie mit einem Bleistift die Obergrenze, bis zu der die Lösung gelangt ist und föhnen Sie die Platte trocken (oder lassen Sie sie an der Luft trocknen, wenn sie im Dschungel mal keinen Föhn dabei haben).

Wenn Sie auf β-Caboline (Harmin und Harmalin) testen, beleuchten Sie die Platte im Dunkeln mit langwelligem UV-Licht. Wenn Sie als Vergleichsstandard ein Extrakt aus den Samen der Steppenraute (Syrische Raute) benutzen, sollten Sie nun in ca. 25% Höhe des lösungsmittelgetränkten Bereiches einen hellgrün leuchtenden Punkt sehen, sowie in ca. 60% Höhe einen blau fluoreszierenden Punkt.

Wollen Sie die Proben auf Tryptamine testen, sprühen Sie mit dem Preval-Sprayer, in dem sich die Ehrlich’s-Lösung befindet, einen feinen Nebel auf die Platte. Wenn Sie drinnen arbeiten, sollten Sie die Platte dafür in einen hochkant gekippten Karton stellen, um das überflüssige Spray aufzufangen. Belüften Sie den Raum außerdem! Sprühen Sie nicht zu lange, sonst kommt zuviel Lösung auf die Platte, und die Proben verlaufen. Beim Sprühen werden die Proben, die sich unterschiedlich weit hochgearbeitet haben, als farbige Punkte erkennbar. DMT und 5-MeO-DMT machen sich als purpur bis violette Punkte auf ca. 35% Höhe der Platte bemerkbar.

Um DMT und 5-MeO-DMT zu unterscheiden, benutzen Sie Xanthydrol-Reagens als Spray – dies macht den Unterschied sichtbar. Xanthydrol ist sehr instabil und muss gefroren aufbewahrt werden, außerdem sollten Sie alle paar Tage die benötigt Menge Reagens frisch herstellen. Dazu werden 100mg Xanthydrol mit 95ml Ethanol (95%) und 5ml konzentrierte Salzsäure gemischt. Diese Mischung wird wie oben beschrieben auf die Platte gesprüht. Hier ist es jedoch besser, mit Kompressor und einem Unterdruck-Zerstäuber aus Glas zu arbeiten, weil der Prevel-Sprayer dafür zu empfindlich ist. Bei der Reaktion mit Xanthydrol wird DMT als violetter Punkt und 5-MeODMT als blauer Punkt sichtbar, beide im gleichen Bereich. Die Größe dieses Punktes entspricht ungefähr der Konzentration. ■

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